Im Jahr 1512 erhält Martin Luther an dieser Kirche einen Predigtauftrag und hat hier rund 2000mal gepredigt. Weihnachten 1521 wird hier der erste evangelische Gottesdienst in deutscher Sprache und mit Abendmahl in beiderlei Gestalt (Brot und Wein) gefeiert. In den Jahren 1521/22 – Martin Luther befindet sich auf der Wartburg – wird die Kirche bei einem „Bildersturm“ ihres traditionellen Bilderschmucks beraubt. Nach seiner Rückkehr von der Wartburg leitet Martin Luther mit seinen Predigten ab Sonntag Invokavit 1522 einen gemäßigten Gang der Reformation ein. 1525 werden Martin Luther und Katharina von Bora durch Johannes Bugenhagen hier als Ehepaar eingesegnet. Der Reformationsaltar von Lucas Cranach wird 1547 errichtet.
Nachdem im Schmalkaldischen Krieg die Turmhelme abgetragen wurden, um Platz für Kanonen zu schaffen, werden von 1556 bis 1558 die heutigen Turmaufsätze für Turmuhr und Türmerwohnung geschaffen. 1569/70 wird der Sakristeibau erhöht und der gesamte Ostteil wird mit einem neuen Chordach versehen, die Sakristei erhält ihre heutige Wölbung. Die steinerne Brücke zwischen den Türmen entsteht 1655/56.
Nach der Besetzung der Kirche durch napoleonische Truppen ab 1806 erfährt der Innenraum 1810 bis 1811 eine umfassende Neugestaltung im Stile der klassizistischen Neogotik. Der Raum des Südportals wird erhöht. Bei einer weiteren Renovierung 1928 wird ein Teil dieser Umgestaltung beseitigt und der Raum erhält im Wesentlichen seine heutige Gestalt. Für das Reformationsjubiläum 2017 wird die Stadtkirche mitsamt ihren Kunstwerken umfassend saniert.